冠心Ⅱ号方四种有效成分对体外培养心肌细胞免疫性损伤保护作用的研究

李彩熙 张金妹 李洪海 王 智 张 京
高凤辉 刘志云 尚小泓 李燕娜 周庆保
李连达 指导
根据“活血化瘀”治则拟定的冠心Ⅱ号，临床证明以冠心病有较好的疗效[1，2]，它可使症状缓解，心电图改善，逐步增加冠状循环指数，改善微循环，并在动物实验中观察到具有增加冠脉血流量及供氧量，保护心肌缺血，抑制ADP胶原诱导的血小板聚集以及降低血脂等作用[3，4]。
但是，冠心Ⅱ号方在冠心病的治疗和实验研究中关于免疫机理方面的工作很少，本试验用心脏组织致敏的大白鼠淋巴细胞对体外培养的大白鼠心肌细胞的细胞毒性来造成免疫性心肌损伤，然后观察冠心Ⅱ号方有效成分如：丹参酮ⅡA磺酸钠、川芎嗪、儿茶精及没食子酸乙脂的保护作用。以形态学方法和同位素51Cr释放率为指示，检查心肌细胞损伤的程度，来研究冠心Ⅱ号方某些有效成分的作用。
1、 材料和方法
1.1 药物
（1）丹参酮ⅡA磺酸钠注射液：上海第一制药厂产，批号810324，含量5mg/ml，测K+：0，Na+:38.33mEq/L。
（2）川芎嗪注射液：北京第四制药厂产，批号291330，含量20mg/ml，测K+：0，Na+0，Ca++：0。
（3）儿茶精：由湖南医药工业研究所植化室从中药赤芍分离提取，分子量290，K+：527mEq/L,Na+:132mEq/L,Ca++:9.0mg%。
（4）没食子酸乙酯：由湖南医药工业研究所植化室从中药赤芍分离提取，分子量198，K+：4.90mEq/L,Na+:127.6mEq/L,Ca++:9.5mg%。
1.2 动物
试验用150~200g Wistar种大白鼠。
1.3 体外培养心肌细胞（靶细胞）
试验用体外培养2~3天的大白鼠乳鼠心肌细胞，其培养方法参看文献[5]，并在培养瓶中放入盖玻片条。
1.4 致敏淋巴细胞的制备（效应淋巴细胞）
（1）抗原：根据I.Friedman等[6]方法制备抗原，用150~200g Wistar种大白鼠在无菌条件下取出心脏、肝脏组织，移到盛有冷生理盐水的烧杯或平皿中，轻轻剥离除去被膜、脂纺组织及血块，用冷生理盐水洗3次，剪成块，放入高速度组织捣碎机内捣碎2~3分钟，制成20%组织匀浆，放入冰箱备用。以上操作均在冰浴中进行。
（2）免疫：将上述组织抗原用含有5mg/ml卡介苗的福氏完全佐剂等量混合乳化成乳剂，给大白鼠四脚掌各注射0.1~0.2ml免疫。
（3）细胞悬液的制备：参照张绍元等方法[7]制备。免疫后10~12天，在无菌条件下取出四肢局部淋巴结，放到盛有冷Hanks液的平皿中轻轻剥离除去脂肪、连接组织及血块，冷Hanks液洗3次，然后切成碎块，移到离心管中加适量的冷Hanks液，用毛细管吹打使细胞分散，然后在冰槽是中静置5分钟，使组织块沉下去，吸取上清放到另一个离管中，将沉淀用同样的方法分散细胞3次。收集含有分散细胞的上清液1500~2000转/分离心5分钟，洗3次。最后用含10%~20%小牛血清的Eagle液悬浮细胞。用血球计数器计总细胞数和死细胞数，用于细胞毒试验的淋巴细胞经台酚蓝染料排斥试验死细胞不应超过10%。
试验用心脏组织匀浆福氏完全佐剂抗原致敏的大白鼠淋巴细胞，对照组用肝脏组织匀浆福氏完全佐剂抗原致敏的大白鼠淋巴细胞（简称肝脏对照），生理盐水福氏完全佐剂抗原致敏的大白鼠淋巴细胞（佐剂对照）和正常大白鼠淋巴细胞（简称正常对照）。
1.5 淋巴细胞的细胞毒性度验方法
淋巴细胞的细胞毒性试验参照菊地洁吉和北医[7，33]的方法稍加改进。体外培养36~45小时的心肌细胞培养瓶中，在无菌操作下加入含20%小牛血清的Eagle培养液悬浮的淋巴细胞悬液（浓度为3000万/ml）3ml，置37度恒温箱中孵育。在培养不同时间10分、30分、60分、3小时、6小时、12小时及24小地取出培养瓶中的盖玻片条，用无菌生理盐水仔细冲洗，并用瑞氏——姬姆萨染色液复染，在光学显微镜下观察形态变化。
没加玻璃条的培养瓶在3小时和24小时两个时间点，在倒装显微镜下观察动态变化。
1.6 用51Cr释放作淋巴细胞细胞毒性试验方法：参照菊地洁吉的方法[7]稍加改进
（1）靶细胞的标记：取每毫升含0.7—3×107个心肌细胞悬液1ml加入30~60 µci51Cr-Na51CrO4 在37℃普通恒温箱中温育60分钟，随时振荡，标记完之后2000转/分离心10分钟，去掉上清，用10%小牛血清Eagle清3次，最后用培养液稀释成5×105/ml浓度的细胞悬液作为靶细胞备用。
（2）效应细胞：效应淋巴细胞的制备方法同方法（四），其浓度为15×107/ml。
（3）细胞毒性试验：将标记靶细胞分装于小试管（直径1.3×10cm ）内每管0.5ml，再加入0.5ml效应细胞，总体积为1ml，每组3管，另取3管各分装0.5ml标记靶细胞和0.5ml培养液作自然释放对照组，37℃温育3小时。另取3管各分装0. 5ml标记靶细胞，再加1.5ml蒸馏水，反复冻融3次，作最大释放对照组。取出试验各管用井型r计数器测定总放射性强度cpm，然后每管经2000转/分离心10分钟，分别取0.5ml放入另一个空管中测上清液的放射性强度cpm。冻融管离心后分别取上清液1ml测放射性强度cpm。
淋巴细胞特异杀伤作用以51Cr特异释放率来表示，按下列公式计算：
每管靶细胞51C释放率=每管上清cpm/每管总cpm×100
每组靶细胞特异释放率=（试验管释放率均数—自然释放率均数）/（最大释放率均数—自然释放率均数）×100
在本试验中自然释放率一般控制在20%以下，最大释放率在80%~95%之间。
1.7 冠心Ⅱ号方几种有效成分对心肌细胞免疫性损伤保护作用的试验
（1）细胞毒性试验的形态学方法（五），但在试验组每瓶心肌细胞中加入不同浓度的各种药物0.05ml，对照组包括不同浓度中药对照和致敏淋巴细胞对照。
（2）细胞毒性试验51Cr释放率测定试验方法同前，但在试验组每管中加入致敏淋巴细胞的同时加入不同浓度的中药。
2、 结果
2.1 致敏淋巴细胞对体外培养心肌细胞的损伤作用
把心脏组织匀浆致敏的淋巴细胞加到体外培养心肌细胞之后10分钟在光镜下观察，心肌细胞已有不同程度的变化：1、心肌细胞足突消失，细胞逐渐变圆或椭圆型；2、细胞固缩，体积减小，浓染；3、胞浆内形成大小不等的空泡或颗粒增多；4、细胞胞浆破裂只剩下变形的核或胞浆碎片和颗粒；5、淋巴细胞浸润在胞浆内；6、心肌细胞和淋巴细胞形成细胞团而被浓染等病变的细胞散在于正常心肌细胞之间，随着温育时间延长，病变加重，范围扩大，3小时病变细胞达半数以上，6小时大量细胞脱壁，24小时大面积细胞从瓶壁脱落或只有极少数病变的细胞散在于瓶壁上，然而肝脏对照组和佐剂对照组虽然有淋巴细胞的浸润，但直到24小时仍保持完整的单层心肌细胞，说明被致敏的淋巴细胞能特异地识别抗原并与它起作用，大白鼠正常的淋巴细胞对体外培养心肌细胞无损伤作用。
2.2冠心Ⅱ号方几种有效成分（丹参酮ⅡA磺酸钠、儿茶精、川芎嗪及没食子酸乙酯）对体外培养心肌细胞免疫损伤的保护作用
（1）形态学观察：根据本文淋巴细胞毒性试验结果，实验第3及24小时在光镜下观察几种有效成分对损伤的保护作用。处理方法同前。
结果表明：不同浓度的丹参酮ⅡA磺酸钠对心肌细胞免疫性损伤有明显保护作用。对照组同前所述3小时后大量淋巴细胞浸润，形成大小不等的空泡，颗粒增多，足突消失，细胞变形，胞浆破裂，核变形等，到24小时大面积心肌细胞脱落。然而加入丹参酮ⅡA磺酸钠的试验组，随着浓度的增加淋巴细胞浸润减少，病变减轻，至24小时心肌细胞仍保持单层细胞。当培养基中丹参酮ⅡA磺酸钠浓度增到2.1×10-4M时在心肌细胞中淋巴细胞的浸润很小，细胞膜及核膜较完整，但胞浆内有很多大小不等的空泡，只加2.1×10-4M药的对照管中心肌细胞较稀少，体积变小似乎生长不良，而加至2.1×10-5M时没有这种现象，可能与高浓度时药物本身的毒性作用有关，即高浓度（2.1×10-4M）的丹参酮ⅡA磺酸钠对淋巴细胞的毒性作用有明显的抑制作用，而对心肌细胞也有一定的毒性作用，因此，在其他试验中均用低于2.1×10-4M的浓度。
儿茶精、没食子酸乙酯等分别加到培养瓶后最终浓度为1.6×10-5M和1.6×10-6M，观察了对心肌细胞免疫性损伤的保护作用。结果表明1.6×10-5M时儿茶精，没食子配乙酯，川芎嗪均有不同程度的保护作用，儿茶精最明显，川芎嗪最差，没食子酸乙酯在两者之间。而1.6×10-6M浓度时三者保护作用均不明显，经24小时后心肌细胞损伤较重，并脱落。
（2）动态变化的观察：根据上述试验结果，选择丹参酮ⅡA磺酸钠2.1×10-5M浓度用不同的方法加到心肌细胞中，在倒装显微镜下观察其动态变化。
对照组为把致敏淋巴细胞加入到心肌细胞中，试验第一组为把丹参酮ⅡA磺酸钠和致敏淋巴细胞同时加到心肌细胞中；试验第二组为先把丹参酮ⅡA磺酸钠加到心肌细胞中作用20分钟后再加入致敏淋巴细胞；第三组为先把丹参酮ⅡA磺酸钠加到致敏淋巴中作用20分钟后南加入心肌细胞中。各组均在37℃温育，至3小时和24小时后倒装显微镜下观察。
对照组，3小时后主要变化为细胞变形（足突消失，变圆），淋巴细胞浸润，24小时后绝大多数细胞从瓶壁上脱落下来，然而各试验组3小时后，以少量淋巴细胞浸润为主，无心肌细胞变形，多数单个细胞仍有节律性自发性的博动，24小时仍保持完整的单层细胞，并观察到胞浆还很饱满。
有趣的是3小时观察之后换液，把多余的淋巴细胞和药物倒掉，继续培养18~36小时，并进行观察。结果，试验第一组在18小时多数心肌细胞变形、脱落，找不到正常心肌细胞（与对照组相似），而试验第二、三组直至36小时时仍保持单层的心有细胞，可见到第三组心肌细胞比第二组生长更饱满。从上所述结果说明丹参酮ⅡA磺酸钠对淋巴毒性引起的体外培养心肌细胞的损伤确有保护作用，其作用机理有待进一步研究。
（3）51Cr释放率测定：当用51C标记的心肌细胞（靶细胞）与已被同种抗原致敏的淋巴细胞（效应细胞）作用时靶细胞被破坏并释放51Cr到培养基中，测定其放射性强度(cpm)可作为靶细胞损伤程度的指标并用于观察药物的保护作用。实验中应注意标记靶细胞51Cr自然释放率的控制和靶细胞与效应细胞适当比例的选择。
1）不同温育时间对标记靶细胞51Cr自然释放率的影响：结果见表。
表89-1 不同时间靶细胞51Cr自然释放率的比较
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时间（小时） 3 24
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试验1 10* 33.2
试验2 13.45 29.0
试验3 7.3 30.49
X 10.25 30.89
*单位为百分率(%)
2）靶细胞和效应细胞的比例对特异释放率的影响：靶细胞和效应细胞比例为1：50，1：100，1：200和1：300，37℃作用3小时后检测特异释放率，随着效应细胞比例的增加，特异释放率也增加，为了在较短时间内得到较好的试验结果，两者的比例定为1：300。
3）保护试验结果
丹参酮ⅡA磺酸钠不同浓度和效应细胞加到标记靶细胞中，37℃作用3小时，四个给药组和对照组的特异释放率。
试验结果对照组（V组）特异释放率为21.11±1.06，试验组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ）分别为4.235±1.13,3.44±2.57,6±3.88和6.46±5.39，与对照组比较经统计学处理均有显著差异。
I组：靶细胞+效应细胞+丹2.1×10-5M； II组：靶细胞+效应细胞+丹2.1×10-6M
III组：靶细胞+效应细胞+丹2.1×10-7M ; IV组：靶细胞+效应细胞+丹2.1×10-8M
V组：靶细胞+效应细胞，不加任何药物。
（分别为P<0.001,P<0.001,P<0.01和P<0.05）。
4）丹参酮ⅡA磺酸钠对致敏淋巴细胞直接作用的观察：
为了观察丹参酮ⅡA磺酸钠对致敏淋巴细胞是否有直接杀伤作用，在1000万/ml致敏淋巴细胞中，加入丹参酮ⅡA磺酸钠至最终浓度为2.1×10-5M和2.1×10-7M，37℃温育30，60及180分钟，以台酚蓝染料排斥试验观察其死细胞比例，结果见表89-2。
表89-2 丹参酮ⅡA磺酸钠对致敏淋巴细胞直接作用的比较
时间（分） 0 30 60 180
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致敏淋巴细胞 3.3 3.0 4.49
致敏淋巴细胞+2.1×10-5M丹 2.9* 3.4 3.15 4.5
致敏淋巴细胞+2.1×10-7M丹 3.5 2.8 4.56
*死细胞百分率%
从表可见致敏淋巴细胞在试管内随时间的延长增加死细胞比例的趋势，但是加药物无明显差异，初步认为丹参酮ⅡA磺酸钠对致敏淋巴细胞没有直扫杀伤作用。
3 、 讨论
3.1 心血管病和免疫的关系
免疫系统是机体重要的防御机构。免疫应答的异常可致机体生理机能的失调和组织损伤，即在某机体受抗原（包括异种抗原，同种异体原及自身抗原）剌激后，出现特殊的致敏状态，当同种抗原再次进入已经致敏的机体时，即可与体内形成的特异性抗体或致敏淋巴细胞发生反应导致组织损伤[8，10]。心血管系统是这种变态反应性炎症易发生的脏器中有代表性的一系统[9]，如果心脏和血管组织成分由于某种原因[11，12]而在血中出现，首先与免疫活性细胞T、B细胞接触，这时在某种情况下错认为非已产生抗体并致敏淋巴细胞，经一系列复杂的机制引起血管壁损伤。血管壁的损伤是血浆脂类沉积在动脉内壁的重要条件，是引起动脉纤维性增厚的直接原因，从而直接或间接地引起冠心病，心肌及心内膜自身的炎症性病变[8~11，13~15，19，25]。近年来随着免疫学的发展，不仅由风湿性心脏病、心肌炎及心肌梗死等患者血清中检测到抗病人自己心脏组织的自身抗体（心脏反应抗体）[15~17]，而且在其末梢血淋巴细胞中被证明对体外培养人胚心肌细胞有细胞毒性作用的效应淋巴细胞[11，16，18]，在尸检研究中显示心肌和瓣膜中免疫球蛋白和补体的存在，心肌间质结缔组织和血管周围可见到淋巴细胞和多核白细胞的浸润[8，9，17]。从上所述充份说明心血管病与机体免疫功能有密切关系，近年来随着细胞生物学的发展，利用体外培养心肌细胞造成体外培养心肌细胞免疫性损伤来研究其病因学[6，20~24]证明在心血管病发病中抗体、补体、致敏淋巴细胞及一些活性物质起很重要的作用，然而致今其因果关系还不十分清楚。
在我们的试验中把心脏组织致敏的淋巴细胞加到体外培养心肌细胞时引起心肌细胞的损伤，其损伤的程度决定于致敏淋巴细胞的质量数量及其作用时间。而肝脏组织致敏的淋巴细胞对体外培养心肌细胞的细胞毒性或仅有少量的淋巴细胞浸润，可见有较高的器官特异性。佐剂对照有轻微的细胞毒性，明显低于心脏致敏的淋巴细胞，与I.Friedman得到的结果一致，可能是卡介苗非特异性的致敏淋巴细胞的结果而引起的。正常大白鼠的淋巴细胞对体外培养心肌细胞没有细胞毒性作用。提示可以在体外造成心血管系统的病理模型作为进一步研究其病因学、药理学及药物免疫学的一种手段。
3.2 冠心２号方的几种有效成分对体外培养心肌细胞免疫性损伤的保护作用
活血化瘀为中医常用的祛邪方法。这类药多数认为对特异性免疫有抑制作用。北医用“肾炎化瘀汤”治疗急、慢性肾炎、过敏性肾炎取得了较好的疗效，以白细胞移动抑制试验和免疫荧光检查，结果提示该方有抑制细胞免疫和体液免疫的作用[26]。还有用活血化瘀药物为主的“益肾汤治疗慢性肾炎取得较好的疗效，其机制是抑制了免疫反应所造成的肾小球毛细血管基底膜的损伤，证明具有抗变态反应性炎症的作用[27，28]。首都医院产科用活血化瘀药预防ABO型新生儿溶血性黄恒取得了较满意的效果，进行溶血空斑试验和血清凝集反应试验证明该方抑制了体液免疫[29]，从上所述运用活血化瘀治疗和其中药防治免疫性疾病已取得了一定的成就。
本试验用丹参、赤芍及川芎中提取的有效成分丹参酮ⅡA磺酸钠、儿茶精、没食子酸乙酯及川芎嗪，观察了对体外培养心股细胞免疫性损伤的保护作用，结果表示几种有效成分均有不同程度的保护作用，其作用机制还不清楚。S.N.Bykovskaja等认为致敏淋巴细胞与携带相应抗原的靶细胞接触时被激活并释放多种淋巴因子[30~32]，同时刺激靶细胞改变其膜的通透性[34]等经一系列复杂的机制溶解、破坏靶细胞。因此，效应细胞必须与靶细胞直接接触才能产生毒性作用，本试验支持这个观点。在本试验中当丹参酮ⅡA磺酸钠和效应细胞先作用20分钟后再加入到心肌细胞作用或者丹参酮ⅡA磺酸钠心肌细胞先作用20分钟后再加入效应细胞时保护作用比丹参酮ⅡA磺酸钠和效应细胞同时加入到心肌细胞为好，这些结果提示丹参酮ⅡA磺酸钠可能作用于淋巴细胞抑制它被激活或作用于靶细胞保护其膜的通透性。初步试验表示丹参酮ⅡA磺酸钠对致敏淋巴细胞没有直接杀伤作用。决之，其作用机制有待进一步研究。
本文的初步结果表时冠心Ⅱ号方对心血管疾病的治疗作用不仅限于改善冠脉循环，预防血栓形成和促进血栓溶解及降血脂等作用，而且在调整、稳定免疫系统功能方面起一定的作用。
3.3 对方法学的评价
细胞溶解性T淋巴细胞是胸腺依赖淋巴细胞的一种亚型，直接和靶细胞接触，经一系列的复杂机制将靶细胞杀伤和破坏。在免疫的人和动物淋巴细胞中只有少量（1%~2%）效应淋巴细胞具有细胞毒性作用。淋巴细胞毒性试验，反应是直接的，较简便，重复性好，目前在临床和实验研究中已被广泛使用。
本试验以形态学（定性）和51Cr释放率（定量）测定方法进行淋巴细胞毒性试验，较客观的反映靶细胞（心肌细胞）损伤的程度及药物保护作用。结果表明今后在实验室研究工作中这是一种可以利用的简便、可靠的方法。但在某些方面还需要进一步改进。比如，形态学方法的定量化以及如何把51Cr自然释放率降低到一定的水平等。
89.4 小结
（1）本试验用大白鼠心脏组织致敏的大白鼠淋巴细胞对体外培养大白鼠乳鼠心肌细胞的细胞毒性来造成心肌细胞免疫性损伤模型，结果表明其损伤有高度的器官特异性，为进一步中西医结合研究心血管病的病因学、药理学、药物免疫学等提供一种手段。
（2）冠心II号方几种有效成分对这种损伤有不同程度的保护作用。并对其作用原理进行了初步探讨，推测冠心II号方在机体内调整、稳定免疫系统功能方面起一定的作用。
参考文献
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